La saliva: una alternativa para el diagnóstico de la infección por Virus de Inmunodeficiencia Humana

INTRODUCCIÓN

La identificación serológica de anticuerpos contra el virus inmunodeficiencia humana (VIH) en sangre es el método más ampliamente utilizado para el diagnóstico de infección por VIH desde mediados del decenio pasado, poco después de que el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) fuera identificado por primera vez (1). Muchas de las pruebas diseñadas fueron ensayos inmunoabsorbentes (ELISA), inicialmente usados para detectar anticuerpos anti VIH-1 y luego para hallar anticuerpos anti VIH-1 y VIH-2.

Mientras la mayoría de los investigadores se abocaron en los análisis serológicos para obtener pruebas cada vez más sensibles, otros observaron que la saliva podría convertirse en una alternativa aceptable e incluso favorable, como lo demostrara Archibald y col. (2) en 1986, a solo tres años del aislamiento e identificación del virus causal.

Recientemente, en países donde la incidencia de la infección es alarmante, el análisis de fluidos bucales como la saliva, surge como una opción rápida, económica y eficaz, a las pruebas serológicas realizadas tradicionalmente para el despistaje de anticuerpos anti VIH (3).

Aún cuando Archibald y col. (2) fueron los primeros en demostrar la presencia en saliva de IgA anti-VIH en 42 de 48 individuos VIH positivos estudiados, Parry y sus colegas (4) un año más tarde (1987), evidenciaron, usando un ensayo de fase sólida, que la presencia de IgA anti-VIH en saliva de individuos infectados se encuentra en niveles más bajos que la IgG anti-VIH

Este hallazgo resulta importante si se considera que, en condiciones normales, la IgA secretora (IgAs) se encuentra en la saliva en grandes proporciones, muy por encima de las otras clases de inmunoglobulinas. Pero como se mencionó anteriormente, y por razones que hasta la fecha se desconocen. El contenido de IgG en la saliva de individuos infectados por VIH aumenta paulatinamente a lo largo de la infección, mientras que la IgAs disminuye sus niveles por debajo de los límites normales. Esto podría explicar la aparición de las lesiones bucales características de los infectados por el virus si tomamos en cuenta que la IgAs, que es la responsable de la respuesta inmunológica humoral local de esa mucosa, se encuentra reducida.

En 1994, Frerichs y col. (3) realizan un estudio en saliva que hasta el momento representa la muestra más amplia. Un total de 1955 individuos fueron estudiados, para determinar la presencia de infección por VIH a través de la saliva, con fines epidemiológicos en Tailandia. Para ello incluyeron individuos usuarios de drogas intravenosas, mujeres prostitutas y pacientes atendidos en clínicas de enfermedades de transmisión sexual.

Las muestras fueron recolectadas utilizando el instrumento de colección Omni-Sal y analizados utilizando un ensayo inmunoabsorbente de captura de anticuerpos IgG anti VIH en saliva (GACELISA), comprando los resultados obtenidos con las muestras de suero de los mismos pacientes, las cuales fueron analizadas utilizada en ELISA para despistaje y Western Blot para confirmación. Los resultados de esta investigación arrojaron una sensibilidad de 98% y especificidad de 99.4 % con el ensayo en saliva, en comparación con los obtenidos en suero, lo que confirma que este fluido es tan confiable para el diagnóstico de la infección como la sangre.

El método de determinación de anticuerpos anti-VIH 1 a partir de saliva fue aprobado recientemente por la FDA en los Estados Unidos (5).

Objetivos de trabajo

El objetivo de nuestro estudio fue confirmar la utilidad de la saliva como una herramienta de diagnóstico para la detección de anticuerpos anti-VIH.

Población estudiada:

Las muestras de suero y saliva [provenientes de 90 individuos (42 hombres - 48 mujeres con edades comprendidas en un rango de 18 a 66 años con una media de 36.7)] fueron recolectadas entre diciembre de 1996 y marzo de 1997. Los participantes fueron reunidos en tres grupos: I) 23 pacientes con diagnóstico previo de infección por VIH, con un rango de edad entre 18 y 48 años con una media de 34.7, II) 47 individuos escogidos al azar, por diagnosticar, con un rango de edad entre 20 y 64 años con una media de 37.1, y III) 20 individuos sanos (grupo control) con un rango de edad entre 19 y 66 años con una media 38.1.

Recolección de muestras:

Tanto las muestras de saliva como las de sangre fueron recolectadas el mismo día. Primero se realizó la extracción de sangre en el Servicio de Inmunología del Instituto de Oncología y Hematología-MSAS y luego, el paciente fue referido al Servicio de Clínica Estomatológica de la Facultad de Odontología-UCV para la toma de la muestra de saliva. Ambas muestras se obtuvieron entre las 7 a.m. y las 12 p.m.

Las muestras de sangre y saliva fueron recolectadas en cada individuo usando los sistemas Vacutainer (Sherwood Medical, St. Louis, USA) y Omni-Sal (Saliva Diagnostic Systems, Inc. SDS, Vancouver - Washington, USA), respectivamente. El equipo Omni-Sal fue usado para la colección, transporte y filtración de la muestra de saliva (Fig. 1) antes de su análisis con el estuche ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva.

La saliva fue recolectada colocando la almohadilla colectora en la boca, específicamente debajo de la lengua indicando al paciente cerrar la boca sin morder o succionar la almohadilla, hasta que un indicador ubicado en su mango se tornó azul, lo que señaló que una cantidad suficiente de fluido había sido absorbida (1 ml aproximadamente).

Transporte

Para el transporte al Instituto de Oncología y Hematología MSAS, donde se realizó la prueba, la almohadilla fue introducida en un tubo estéril permitiendo el contacto con el medio de transporte que consta de una solución buffer y un preservativo (0.2 % Azida de Sodio). Agentes antimicrobiales y antiproteolíticos en el medio de transporte estabilizan la muestra durante el periodo de tiempo que transcurre entre la recolección y el análisis, con la finalidad de inhibir las enzimas salivales que pudieran desnaturalizar los anticuerpos.

Almacenamiento

Una vez recolectada la saliva con el instrumento adecuado, la muestra fue almacenada a -80°C en refrigerador Revco antes de ser utilizada para la prueba.

Filtracion

Antes de la prueba, el mango fue removido cuidadosamente de la almohadilla la cual permaneció en el fondo del tubo de transporte. Posteriormente, se insertó lentamente el lado de goma del dispositivo de filtrado (POREX Filter Sampler) y se empujó hacia abajo presionando la almohadilla con el fondo hasta obtener el fluido filtrado (volumen de 1 - 1.5 ml libre de células) el cual estaba listo para la prueba con el equipo para saliva ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva o para ser transferido a un tubo limpio y congelado para ser analizado posteriormente.

Análisis de laboratorio

Cada muestra de suero y saliva fue identificada y posteriormente analizada para anticuerpos anti-VIH 1 y 2 utilizando paralelamente el estuche Enzygnost Anti-HIV ½ Plus (Behring, Alemania) e ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva (Organics, Israel) respectivamente, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

El estuche ImmunoComb II VIH 1 & 2 Saliva (Organics, Israel) específicamente diseñado para la rápida detección cualitativa de anticuerpos IgG contra VIH tipo 1 y 2 en saliva humana, es un inmunoensayo de fase sólida constituido por un peine con 12 proyecciones o dientes, cada uno de los cuales esta sensibilizado en tres puntos:

Punto superior - inmunoglobulina humana (control interno)
Punto medio - péptidos sintéticos de VIH 2
Punto inferior - péptidos sintéticos de VIH 1

El estuche cuenta con una bandeja de 6 filas, cada una con 12 pozos. Cada fila tiene una solución lista para ser usada en los diferentes pasos del ensayo. La prueba se desarrolla moviendo el peine de fila en fila.

Para empezar la prueba, las muestras salivales son colocadas en los pozos de la fila A de la bandeja. Luego los dientes del peine se insertan en los pozos de la fila A de manera tal que si los anticuerpos anti VIH se encuentran presentes en la muestra, estos se adhieren a los péptidos sintéticos del punto inferior o medio en los dientes del peine (Fig. 2).

La fila B es una solución de lavado. Seguidamente el peine se desplaza a la fila C en donde la IgG anti VIH es capturada en el punto bajo y medio, y la inmunoglobulina del punto superior (control interno), reaccionarán con los anticuerpos anti - IgG humana marcados con fosfatasa alcalina. En las siguientes filas ocurren dos lavados consecutivos. En la fila F, la fosfatasa alcalina marcada reaccionará con el sustrato homogéneo, obteniendo como resultado un punto gris azulado visible en la superficie del diente del peine.

El equipo incluye un control positivo (que contiene Ac contra VIH 1 y VIH 2) y un control negativo. Una vez que el peine ha recorrido todas las filas de la bandeja (en 37 minutos aprox.), el diente del control positivo mostrará tres puntos grises, y el diente con el control negativo solo mostrará el punto superior, que aparecerá también en los demás dientes del peine, lo que confirmará que el estuche funciona apropiadamente y la prueba fue realizada correctamente (Fig. 3).

Análisis estadístico

Los datos fueron archivados en computadora utilizando el programa Lotus 1.2.3. (Lotus, Cambridge, Massachusetts, USA). Para la estadística de los resultados se utilizó el mismo programa.

El resultado de los análisis en suero fue utilizado como patrón comparativo con los resultados obtenidos en saliva para determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva.

Resultados

• Del total de las 23 muestras de saliva estudiadas provenientes de los pacientes con diagnóstico de infección por VIH 1 (Grupo I), 23 dieron positivo en el análisis con el estuche ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva. Lo mismo ocurrió con las muestras de sangre de los mismos pacientes al ser analizadas con el estuche Enzygnostic Anti-HIV ½ Plus para suero.
• De las 47 muestras obtenidas en individuos escogidos al azar (Grupo II), 6 fueron positivas y 41 negativas al utilizar el estuche ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva. Lo mismo ocurrió con las muestras de sangre de los mismos pacientes al ser analizadas con el estuche Enzygnostic Anti-HIV ½ Plus para suero.
• De las 20 muestras obtenidas del grupo control (Grupo III), todas resultaron negativas para anticuerpos anti-VIH 1 al análisis con el estuche ImmunoComb II HIV 1 & 2 Saliva. Lo mismo ocurrió con las muestras de sangre de los mismos pacientes al ser analizadas con el estuche Enzygnostic Anti-HIV ½ Plus para suero.

Discusión

Como puede evidenciarse en nuestros resultados, donde obtuvimos una sensibilidad de 100% y una especificidad de 100% el empleo de la saliva es una alternativa viable, rápida y eficaz para el diagnóstico de infección por VIH y como herramienta epidemiológica en aquellos contextos donde la recolección de sangre venosa pueda ser impráctica (6).

El costo de la prueba es una de las ventajas de mayor consideración, especialmente en los países en vías de desarrollo, ya que estamos en presencia de un fluido, aparte del suero, que ofrece resultados similares y que requiere de una mínima inversión para la recolección.

La sangre de los individuos VIH positivos debe ser considerada como un fluido peligroso que puede infectar ocasionalmente a los trabajadores de la salud (7). Las exposiciones (con sangre infectada) pueden ser prevenidas con el uso de barreras de precaución, conductos apropiados y técnicas seguras. Por supuesto que el empleo de estas normas de seguridad incrementa el costo, tanto en entrenamiento como en suministros, por lo que la saliva es un medio más seguro que la sangre por cuatro razones: 1. Evidencias epidemiológicas y estudios de laboratorio han demostrado que el virus rara vez está en la saliva de individuos VIH positivos (8,9); 2. Si se encuentra en saliva, las concentraciones del virus tienden a ser muy bajas (8); 3. Parece ser que existe un factor en la saliva que inhibe el poder de infección de virus (10,11) y 4. No existe posibilidad de injuria con objetos punzo-penetrantes (agujas, tubos de ensayo) asociada a la recolección de la maestra. Incluso la mordida de un paciente infectado con VIH es incapaz de transmitir la infección vía salival (12).

La saliva puede ser recolectada sin la necesidad de instrumentos como agujas, jeringas, alcohol, gasas y guantes, sin embargo, el uso de un colector especial que indique el volumen adecuado de recolección y una sustancia buffer estabilizadora de los anticuerpos anti-VIH, previo al análisis de laboratorio, podría ser muy útil. Por otra parte, el hecho de que una injuria cutánea no sea necesaria para la recolección de la muestra, hace que los análisis basados en saliva sean más aceptados ofreciendo la ventaja de una recolección exenta de dolor. Finalmente, el dispositivo de recolección salival es menos problemático que las agujas y jeringas las cuales pueden ser robadas y reusadas como equipo contaminado.

La saliva es especialmente útil para el diagnóstico de infección por VIH en grupos como los Usuarios de Drogas Intravenosas (UDIV) los cuales pueden presentar los vasos sanguíneos colapsados (13), prisioneros (14) o trabajadoras sexuales quienes pudieran por algún motivo rechazar el ser analizados. Por otra parte, como la toma de la muestra no está asociada a dolor y es muy rápida, se aprecia una mayor receptividad por parte del paciente, pudiendo ser utilizada con fines de diagnóstico precoz y pesquisa en grupos militares, ancianos, niños, bebés, discapacitados mentales, presos y atletas, así como en casos preoperatorios, prenupciales, o para solicitud de trabajo (5). En nuestro estudio se utilizó ELISA especialmente diseñado para saliva con alta especificidad (porcentaje de individuos sanos que presentan resultados negativos) y sensibilidad (porcentaje de individuos con anticuerpos anti-VIH que presentan resultados positivos).

Nuestros hallazgos muestran que los anticuerpos anti-VIH pueden ser detectados tanto en saliva como en suero, por lo que se recomiendan las pruebas en saliva para diagnóstico de infección por VIH como una alternativa aceptable a los test convencionales en sangre.

Agradecimiento

Los autores desean agradecer a Jesús Muñoz de la Universidad de Alabama en Birmingham, E.E.U.U., por transcribir de la versión electrónica de este manuscrito.

Referencias

1. World Health Organization: The current global situation of the HIV/AIDS pandemic. Wkly Epidemiol Rec 1994, 69:7-8
2. Archibald D, Zon L, Groopman J, McLane M, Essex M: Antibodies to human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III) in saliva of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) patients and in persons at risk for AIDS. Blood 1986, 67:831-834
3. Frerichs R, Silarug N, Eskes N, Pagcharoenpol P, Rodklai A, Thangsupachai S, Wongba C: Saliva-based HIV- antibody testing in Thailand. AIDS 1995, 9:885-894.
4. Parry J, Perry K, Mortimer P: Sensitive assays for viral antibodies in saliva: an alternative to tests on serum. Lancer 1987, 335:72-75.
5. Rota T, Sheldrake I, Zavarce I, Graham M, Portillo M, Monzón A, Suarez R: Evaluación del estuche Wellcozyme HIV - 1+2 GACELISA para anticuerpos en saliva, orina y manchas de sangre. Presentado en VII Congreso Venezolano de Bioanálisis - VIII Jornadas Científicas de la S.V.B.E. Abril 1995.
6. Thongcharoen P, Wasi C, Lousirirotchanakul S, Parry J, Connel J, Mortimer P: Immunoglobulin G antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay: a versatile assay for detection of anti-human immunodeficiency virus type 1 and 2 antibodies in body fluids. J Clin Microbiology Dec 1992, 3288-3289.
7. Ippolito G, Puro V, De Carli G: The risk of occupational human immunodeficiency virus infection in health care workers. Italian Multicenter Study. Arch Intern Med 1993, 153:1451-1458.
8. Yeung S, Kazazi F, Randle C, et al: Patients infected with human immunodeficiency virus type 1 have low levels of virus in saliva enve in the presence of periodontal disease. J Infect Dis 1993, 167:803-809.
9. Fischl M, Dickinson G, Scott G, Klimas N, Fletcher M, Parks W: Evaluation of heterosexual partners, children and household contacts of adults with AIDS. JAMA 1987, 257:640-644.
10. Archibald D, Cole G: In vitro inhibition of HIV-1 infectivity by human saliva. AIDS Res Hum Retr 1990, 6: 1425-2432.
11. Robinovitch M, Iversen J, Resnick L: Anti-infectivity activity of human salivary secretions toward human immunodeficiency virus. Crit Rev Oral Biol Med 1993, 4:455-459.
12. Richman K, Rickman L: The potential for transmission of human immunodeficiency virus through human bites. J Acquir Immune Defic Syndr 1993, 6:402-420.
13. Covell R, Follet E, Coote I, et al: HIV testing among injecting drug users in Glasgow. J Infect 1993, 26:27-31.
14. Bird A, Gore S, Burns S, Duggie J: Study of infection with HIV and related risk factors in young offenders’ institution. BMJ 1993, 307:228-231.